手把手教会从头设计天然抗体库PCR引物

介绍

通过PCR扩增获得高特异性的抗体基因序列，是构建天然抗体库的重要基础。尽管有许多的文献提供了用于抗体基因扩增的PCR简并引物[1]，但是在PCR扩增过程中，往往会因为实验条件的变化，带来扩增条带特异性差、克隆效率低等问题。因此我们在这里介绍盛世君联公司从头设计天然抗体库PCR引物的过程，方便大家学习，或者用于优化文章中的简并引物。

抗体库（Antibody Libraries）

抗体库是一种包含大量不同抗体的序列DNA文库或者蛋白展示文库，用于存储和提供广泛的抗体多样性。我们通常使用的抗体库，更多的是已经展示在不同载体（噬菌体、酵母、细菌、细胞、核糖体等）上的抗体蛋白展示文库。这些文库中的每个载体所携带的抗体DNA与其所展示的抗体蛋白是一致的，即基因与表型一致。因此对这些文库进行高通量的筛选，可以获得与不同抗原靶点结合的抗体-载体复合物，再对载体基因进行测序，就能获得结合抗原靶点的抗体的DNA序列了。

抗体库是体外快速获得识别、结合抗原蛋白的单克隆抗体的技术，常常被用于检测性抗体和治疗性抗体的开发，目前已有多个基于抗体库筛选获得的抗体上市[2]。 按照库的构建方法，抗体库被分为天然库和合成库（图1），前者通过PCR扩增B细胞的抗体基因获得含有多种天然抗体基因的混合文库（包括使用未免疫的人或者动物的B细胞构建的天然抗体库，和使用动物免疫后的B细胞构建的免疫抗体库），后者通过突变技术对某个或者某几个模板抗体的CDR区域进行高通量突变获得含有不同CDR序列的突变体混合文库。本文主要讨论天然抗体中用于抗体基因扩增的PCR引物的从头设计。

图1.基于合成抗体库和天然抗体库的抗体研发流程

天然抗体序列数据库

天然抗体库PCR引物设计的第一步，是找到不同物种体内的抗体序列的DNA信息，以下是一些常见的天然抗体序列数据库：

1、 IMGT（https://www.imgt.org/）：IMGT是一个包含广泛抗体和T细胞受体序列信息的综合性数据库。它提供了经过标准化和注释的抗体和T细胞受体的序列、结构和功能信息，并具有强大的搜索和比对功能。

2、 VBASE2（http://www.vbase2.org/）：VBASE2是一个针对人类和啮齿动物的抗体可变区序列的数据库，具有可视化和搜索功能。

3、 SAbDab（https://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/sabdab）：抗体-抗原复合物结构数据库，主要用于存储和分析抗体和抗原之间的结合信息。它提供了复合物的结构、序列和亲和力等相关数据。

天然抗体库PCR引物

我们首先看看天然来源的抗体模板是什么样的？体内的B细胞（通常来源于血液、脾脏、骨髓、或者淋巴结）被裂解后，分离出细胞内的RNA，再转录为cDNA，这些cDNA即是用于扩增抗体基因的模板。模板cDNA除了包括抗体重链或者轻链可变区的

图2.cDNA模板中人抗体组成元件

为了扩增出抗体可变区域，PCR引物的设计有以下几种方式

1、 使用抗体可变区的骨架（Framework）区域1（FW1）和骨架区域4（FW4）设计引物对：可以最精确的扩增抗体可变区，但是由于抗体序列的多样性（图3），FW1区域和FW4区域都需要使用简并引物（图4，以人抗体VH的PCR引物设计为例）。根据抗体基因重排（VDJ重排）的规则可知：人抗体VH的FW1区域主要由抗体V基因的不同亚型决定，而FW4区域主要由抗体J基因的不同亚型决定。因此我们可以在IMGT网站上找到人抗体重链可变区V基因和J基因的不同亚型的DNA序列（https://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/list_alleles.php?species=Homo+sapiens&group=IGHV，和 https://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/list_alleles.php?species=Homo+sapiens&group=IGHJ），用于上下游特异引物或者简并引物的设计（图4）。

图3. VDJ重排和抗体的多样性

图4. 基于FW1和FW4的人抗体VH 区域PCR引物设计

图5. IUB code表

2、 使用FW1和CH1或者CL区域设计引物对：FW1区域使用简并引物，CH1和CL区域设计恒定引物；但对于人/小鼠/兔等物种来说，因为存在不同的抗体亚型（如重链IgG、IgM、IgA等和轻链Kappa、Lambda亚型），CH1和CL的引物往往需要设计多条（图6，以人抗体VH的PCR引物设计为例）。这样设计的好处是：相对固定的下游引物可以提高PCR扩增抗体条带的特异性。我们可以在IMGT网站上找到人抗体重链恒定区不同亚型的DNA序列（https://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/list_alleles.php?species=Homo+sapiens&group=IGHC），用于下游特异引物或者简并引物的设计（图6）。

图6. 基于FW1和CH1的人抗体VH 区域PCR引物设计

3、使用分泌信号肽（SP）和FW4或者铰链（Hinge）区域设计引物对：这种设计往往针对纳米抗体的重链可变区（VHH）的扩增。因为对于人/小鼠/兔等物种来说，抗体VH和VL SP区域的DNA多样性并不低于FW１区域，同样也需要简并引物（图6，以人抗体VH区域分泌信号肽为例）。但对于驼类物种（主要用于纳米抗体的开发）来说，抗体SP区域多样性低，可以在SP区域设计恒定的上游引物，在FW4区域设计简并的下游引物或者在相当恒定的铰链区域设计恒定的下游引物（图7）。羊驼抗体SP区域的DNA来源于参考文献[3]。羊驼抗体铰链区域的DNA序列可以从IMGT上找到（https://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/list_alleles.php?species=Vicugna+pacos&group=IGHC），其中用于纳米抗体扩增的为IgG2亚型的长铰链和短铰链区（图7）。

图7. 人抗体VH区域分泌信号肽DNA序列

图8. cDNA模板中羊驼抗体组成元件和PCR引物设计

特别提醒：本文着重介绍了天然抗体库引物设计的思路和流程，但对于每种引物的序列选择，需要根据实际工作和研发目的进行调整，文中序列仅为参考。

如果需要了解和学习更多的天然抗体库引物设计和构建方法，欢迎关注官方公众号，也可联系微信号18030817139，报名参加公司不定期举行的技术培训课。

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参考文献

[1] J D Marks, H R Hoogenboom, T P Bonnert, J McCafferty, A D Griffiths, G Winter. By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol. 1991; 222(3): 581-97.

[2] Yang Zhang. Evolution of phage display libraries for therapeutic antibody discovery. MAbs. 2023; 15(1): 2213793.

[3] David R. Maass, Jorge Sepulveda, Anton Pernthaner, Charles B. Shoemaker. Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs). Journal of Immunological Methods. 2007; 324(1-2): 13-25.