最全Kunkel突变法，100％突变率！
# 介绍
kunkel突变原理及应用
DNA序列中的任何一个碱基发生替换、插入或缺失的过程被称为基因的定点突变。这种定点突变在基因工程和蛋白质工程中是一种广泛应用的重要技术。有几种常见的方法可以实现基因的定点突变，包括寡核苷酸介导的定点突变、盒式定点突变和PCR介导的定点突变。
为了提高诱变效率，T.A. Kunkel在1985年对寡核苷酸定点诱变法进行了改进。这种改进的方法涉及到将复制型的M13噬菌体转化到脱氧尿苷三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷的E. coli（dut-，ung-）菌株中生长。在这个过程中，尿苷（U）被掺入到DNA链中，替换了原本的胸腺嘧啶（T），从而生成了尿嘧啶单链DNA（dU ssDNA），然后使用含有编码突变的引物与dU ssDNA模板的特定位点进行退火，以引入突变。延伸后，产生了异源共价闭合环状双链DNA（CCC-dsDNA）。最后，将这个异源CCC-dsDNA转化到正常的菌株中（dut+，ung+），含有尿苷的模板链被破坏，新合成的带有突变碱基而不含尿苷核苷酸的新链得以保存下来（图1）。
这种方法明显提高了诱变效率，为基因工程和蛋白质工程的进一步研究和发展提供了有力的工具。
图1. Kunkel突变流程图
Kunkel突变法是一种高效、快速且经济实惠的多位点定点诱变策略，常被用于构建抗体噬菌体展示文库。这种策略在一次反应中能够对抗体所有的互补决定区（CDRs）进行多个位点的组合突变。
kunkel突变条件优化及操作
在构建蛋白质或抗体库的过程中，我们通常会设计简并引物，以便在特定区域（如抗体CDR区域）引入数十亿多样性的突变。抗体库的多样性和质量（有效突变数目）主要取决于Kunkel反应的突变效率。过去的研究表明，单位点突变的效率大约为50%，而多位点突变的效率更低，一般在10-30%左右。在定点突变之后通过酶切消化去除野生型模板也可以有效提高抗体库突变效率。然而，这种策略不仅增加了额外的实验步骤，同时也会显著降低库的多样性。
为了解决Kunkel反应突变效率低的问题，我们优化了DNA模板和诱变寡核苷酸中的密码子，成功降低了互补区域的GC含量。不仅如此，我们还通过调整寡核苷酸的长度，减小了上游和下游互补区域GC含量的差异（如图2所示）。这些改进措施显著提升了Kunkel反应在单一位点和多位点突变上的效率，使噬菌体库的多样性和库容得以提升。此外，在进行多位点突变时，我们发现采用多级退火程序能有效提升突变效率。这些策略不仅优化了蛋白质和抗体库的构建过程，还提高了整个过程的效率和可靠性。
图2. Kunkel突变中的退火反应以及突变引物的区域划分
优化后的kunkel突变操作如下：
1） 设计突变引物，通过对Upstream和Downstream互补区域进行密码子优化和长度调整，将这两个区域的GC含量控制到30%-45% ，示例如下：
野生型WT H2-Oligo（GC%=57.1%-61.9%）：
AAGGGCCTGGAATGGGTCTCATMTATTTMTYCTT
MTTMTRGCTMTACTTMTTATGCGGACTCTGTGGAGGGC
优化后LGC H2-Olig（GC%=33.3%-38.1%）：
AAAGGTTTAGAATGGGTTTCATMTATTTMTYCTT MTTMTRGCTMTACTTMTTATGCTGATTCTGTAGA AGGT
特别提醒：如果引物互补区域进行了核苷酸的调整，其对应的模板区域也要进行相应的改变，这样才能形成引物和模板的互补结合。
2）向突变引物中加入多核苷酸激酶进行磷酸化反应；
3）将反应产物与dU-ssDNA混合，升温变性，然后退火；
4）用T7 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶进行延伸反应合成CCC-dsDNA；
5）纯化回收CCC-dsDNA后转化至ss320（dut+，ung+）感受态细胞，活化后涂布抗性平板，次日即可挑单克隆测序以确定突变效率。
trimer引物设计及优势
Trimer引物是由3个核苷按照预定种类和顺序连接形成三联核苷（Trimer phosphoramidites），这些不同的三联核苷与不同的氨基酸一一对应。这种引物可以满足对蛋白、抗体文库中特定位点氨基酸的多样性和偏好性需求。在突变位点处使用Trimer引物可以避免产生冗余突变和终止密码子。根据氨基酸碱基密码进行设计，密码子与氨基酸一一对应。通过混合元件单元设计引物，可以精准控制突变位点氨基酸比例。
突变引物设计
Trimer引物设计，示例：以如下引物为例，X代表要求的密码子突变位置。
5' GCAACTTATTACTGTCAGCAA X1X2X3X4X5X6TGTX7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17TACX18 CACGTTCGGACAGGG 3'
其中， X1 Trimer=A（80%）：G（3%）：R（3%）：S（3%）：T（8%）：V（3%）。
如何击破突变效率瓶颈
盛世君联采用25℃的培养温度下常规生成dU-ssDNA，使用不同DNA模板和诱变寡核苷酸进行Kunkel突变，发现单位点诱变的突变效率在0-100%之间存在巨大波动。同时发现，在WT D2E7 scFv模板的CDRH3中，寡核苷酸长度的延长和退火温度的改变并没有提高突变效率。因此，我们认为可能存在被忽视的突变效率影响因素。
盛世君联经过深入研究后发现，使用的诱变寡核苷酸的互补区的GC%越低，单位点诱变的突变效率越高。GC%=37.5%-31.3%，Tm℃=38.3℃-35.7℃ 时，突变效率可达到100%。我们认为降低互补区的GC%可以提高Kunkel诱变的效率，并采用两种不同的策略来修饰互补区域的GC%：
1、通过密码子优化来降低DNA模板和寡核苷酸的GC%；
2、改变互补区域的长度。
我们的研究表明，WT D2E7 scFv的密码子可被替换为E. coli中常见的密码子，且GC%相对较低。在合成抗体库中随机选取的L3、H1、H2和H3四个cdr互补区，该工艺将GC含量降低到50%或更低。结果表明，降低L3、H1和H2模板及相应的诱变寡核苷酸的GC%，可显著提高其在Kunkel诱变过程中的突变效率。
同时，我们考虑到改变寡核苷酸长度会影响其Tm值，因此在延长互补区长度以平衡GC%时，我们还考虑了退火温度的变化。
这个过程对于双位点和多位点诱变变得更具挑战性，因为诱变寡核苷酸可能有许多不同的Tm值。在PCR退火步骤中建立了多段冷却程序，该程序提高了基于Kunkel方法的双重诱变和多次诱变的突变效率。
多级冷却过程可作为Kunkel方法双位点或多位点诱变的通用方案，通过消除不同寡核苷酸的Tm计算和最佳单一温度的试验，简化过程。
盛世君联基于上述研究及相关自主专利（专利号：ZL 2019 1 0814448.X），开发了更有针对性的“Kunkel Mutagenesis Kit”，助力广大科研人员及企业提高Kunkel突变法的突变效率，构建具有超高多样性的合成抗体文库。以下为产品详情，如有需要，欢迎联系我们18030817139！
| 货号 | 产品 | 规格 |
|---|---|---|
| K-KM01 | Kunkel Mutagenesis Kit | 20 reactions |
| K-GA01 | One-Step Cloning Kit | 40 reactions |
# 引用
[1] Liu B, Long S, Liu J. Improving the mutagenesis efficiency of the Kunkel method by codon optimization and annealing temperature adjustment. N Biotechnol. 2020 May 25;56:46-53. doi: 10.1016/j.nbt.2019.11.004. Epub 2019 Nov 11. PMID: 31726223.
[2] Huang R, Fang P, Kay BK. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods 2012;58:10-17.
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